DNA測(cè)序經(jīng)歷了Sanger測(cè)序、二代測(cè)序（高通量測(cè)序）及三代測(cè)序（納米孔測(cè)序），日前，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（NIST）模擬了一個(gè)新型基因測(cè)序概念：通過(guò)將DNA分子從微小的、具有化學(xué)活性的石墨孔洞中拉動(dòng)，通過(guò)測(cè)量石墨孔洞邊緣產(chǎn)生的電位變化來(lái)實(shí)現(xiàn)高速、高精度、高效率的DNA測(cè)序；研究人員表明，該方法每秒可識(shí)別660億個(gè)堿基，準(zhǔn)確度為90%且無(wú)假陽(yáng)性；如果該方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，那么將比傳統(tǒng)的測(cè)序方法速度更快，成本更低。相關(guān)研究結(jié)果于近日發(fā)表于《Nanoscale》雜志上。

　　圖：NIST新型DNA測(cè)序原理模型（來(lái)源ScienceDaily）

　　NIST提出的新型DNA測(cè)序方法與納米孔測(cè)序原理的延伸，依賴(lài)于帶電粒子（離子）通過(guò)納米孔道引發(fā)電位變化。盡管一直以來(lái)都受歡迎，但帶電粒子（離子）通過(guò)納米孔道引發(fā)電位變化也面臨很多挑戰(zhàn)，如不必要的電信號(hào)噪聲、干擾以及選擇性不足。為了克服這些困擾，NIST提出的新建議是創(chuàng)建臨時(shí)的化學(xué)鍵和依賴(lài)于石墨烯的能力打破這些化學(xué)鍵，并將產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)變信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘?hào)。引領(lǐng)該項(xiàng)目的NIST理論家AlexSmolyanitsky說(shuō)，“這本質(zhì)上是一個(gè)微型壓力傳感器，我們并沒(méi)有發(fā)明一個(gè)完整的技術(shù)，只是提出了一個(gè)新的物理原理。”

　　由于電氣性和微型薄膜結(jié)構(gòu)，石墨烯在納米孔測(cè)序中很受歡迎。在NIST提出的新方法中，單層石墨納米帶（4.5*15.5nm）附有多個(gè)納米通道（寬度為2.5nm）。于室溫下在水中模擬傳感器的工作原理：胞嘧啶可附著在納米孔中，通過(guò)堿基配對(duì)原理可檢測(cè)出鳥(niǎo)嘌呤；單鏈DNA分子可通過(guò)納米孔；當(dāng)鳥(niǎo)嘌呤通過(guò)孔道時(shí)，與胞嘧啶形成氫鍵；隨著DNA單鏈在孔道中移動(dòng)，石墨烯被猛拉再滑回到原來(lái)的位置，氫鍵斷裂，從而機(jī)械應(yīng)變信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娏餍盘?hào)。

　　NIST的研究主要集中于DNA鏈如何影響石墨烯的電學(xué)性能，并發(fā)現(xiàn)臨時(shí)的電流變化確實(shí)發(fā)生在目標(biāo)堿基通過(guò)孔道的瞬間。為了能檢測(cè)ACTG四個(gè)堿基，擁有不同插入孔的四個(gè)石墨烯帶需垂直堆疊以創(chuàng)建一個(gè)集成的DNA傳感器。

　　研究人員將模擬數(shù)據(jù)與理論想結(jié)合起來(lái)評(píng)估可測(cè)信號(hào)的變化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)信號(hào)強(qiáng)度在毫安范圍，比早期的離子電流納米孔方法要強(qiáng)些?；?0%的準(zhǔn)確率和無(wú)假陽(yáng)性，研究人員認(rèn)為DNA鏈四個(gè)堿基的獨(dú)立檢測(cè)可使準(zhǔn)確率達(dá)99.99%，這個(gè)準(zhǔn)確率也是人類(lèi)所需的。

　　作者最后得出結(jié)論：該方法提供了一個(gè)無(wú)需先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理、顯微鏡或高度受限的操作環(huán)境便可實(shí)現(xiàn)DNA傳感的技術(shù)。除了將堿基附著到納米孔上，其他所有的傳感組件均已被其他研究小組的試驗(yàn)證實(shí)。理論分析表明基本的電子過(guò)濾方法可以過(guò)濾有用的電信號(hào)，該方法將同樣可用于其他應(yīng)變敏感膜，如二硫化鉬。

　　回顧納米孔測(cè)序

　　新型納米孔測(cè)序法（nanoporesequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)核酸聚合物通過(guò)，因而可以在此基礎(chǔ)上使用多種方法來(lái)進(jìn)行高通量檢測(cè)。此外，納米級(jí)別的孔徑保證了檢測(cè)具有良好的持續(xù)性，所以測(cè)序的準(zhǔn)確度非常高。對(duì)于長(zhǎng)達(dá)1,000個(gè)堿基的單鏈DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本無(wú)需進(jìn)行擴(kuò)增或標(biāo)記就可以使用納米孔測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，這使得便宜、快速地進(jìn)行DNA測(cè)序成為可能。

　　1996年哈佛大學(xué)的DanielBranton、加州大學(xué)的DavidDeamer及其同事，在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊PNAS雜志上首次發(fā)表文章指出，可以用膜通道檢測(cè)多核苷酸序列。2005年，Bayley、GordonSanghera和SpikeWilcocks創(chuàng)立的OxfordNanopore公司正式登場(chǎng)。為了開(kāi)發(fā)穩(wěn)定可靠的納米孔測(cè)序平臺(tái)，該公司從2007年開(kāi)始研發(fā)以蛋白為基礎(chǔ)的納米孔測(cè)序系統(tǒng)。2012年，該公司在AGBT(基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會(huì))上發(fā)布了自己的納米孔系統(tǒng)——MinION，從此納米孔測(cè)序真正實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化。然而，納米孔測(cè)序目前還處于發(fā)展初期，錯(cuò)誤率等技術(shù)問(wèn)題還有待突破。